一、蛋白表達(dá)量低：

1.充分了解研究的蛋白，表達(dá)量低適當(dāng)增加上樣量，20-50μg。

2.本底表達(dá)還是誘導(dǎo)表達(dá)，非特異性條帶。

3.樣本提取蛋白使用蛋白酶抑制劑，磷酸酶抑制劑，并設(shè)置對(duì)照，避免蛋白降解。

4.檢查一抗特異性是否適合目的蛋白的種屬，看說(shuō)明書，一抗二抗最好買經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的。

二、蛋白轉(zhuǎn)膜效率低：

1.可以麗春紅染色檢查轉(zhuǎn)膜效率,分子量小的蛋白，注意用小孔莖的膜。

2.適當(dāng)調(diào)整優(yōu)化轉(zhuǎn)膜的時(shí)間和電流。

3.分子量表達(dá)低的選擇超敏的發(fā)光液。

有陽(yáng)性條帶，但條帶比較弱

1.抗體染色不充分：增加抗體濃度，延長(zhǎng)孵育時(shí)間。

2.酶活性降低：直接將酶和底物進(jìn)行混合，如果不顯色則說(shuō)明酶失活了。選擇在有效期內(nèi)、有活性的酶聯(lián)物。

3.標(biāo)本中靶蛋白含量太低：增加標(biāo)本上樣量。

4.洗膜過(guò)度：縮短洗滌時(shí)間。

5.HRP 抑制劑：所用溶液和容器中避免含有疊氮化鈉。

6.抗體活性降低：選擇在有效期內(nèi)的抗體，工作液現(xiàn)配現(xiàn)用，避免長(zhǎng)時(shí)間放置。

7.封閉過(guò)度：減少封閉劑的量或縮短時(shí)間；換用不同封閉劑類型。

8.曝光時(shí)間過(guò)短：延長(zhǎng)曝光時(shí)間。

9.HRP 抑制劑：所用溶液和容器中避免含有疊氮化鈉。

背景高

1.上樣量多：適當(dāng)減少上樣量。

2.洗膜不充分：增加洗液體積和洗滌次數(shù)，原則可以快洗慢孵育。

3. 阻斷不充分：選擇合適的封閉試劑，增加封閉液孵育時(shí)間，封閉濃度。洗滌液中加入 Tween-20 可減少交叉反應(yīng)。脫脂奶粉含有的酪蛋白是一種磷酸化蛋白，會(huì)結(jié)合磷酸化特異性抗體而易產(chǎn)生高背景。使用 BSA 代替奶粉作為封閉劑。

4.抗體過(guò)多：降低抗體濃度，使用單抗，減少二抗孵育時(shí)間

5.檢測(cè)過(guò)程中膜干燥：保證充分的反應(yīng)液，避免出現(xiàn)干膜現(xiàn)象。

6.曝光過(guò)度：縮短曝光時(shí)間。

7.蛋白降解：使用新鮮樣本，加入蛋白酶抑制劑，在冰上操作。

8.膜的選擇導(dǎo)致的高背景：用低背景的NC 膜替換高背景的PVDF 膜。

9.蛋白存在不同的剪切形式：查閱數(shù)據(jù)庫(kù)文獻(xiàn)，了解蛋白的特異性一抗。

非特異性條帶或蛋白條帶大小不對(duì)

1.蛋白降解：加入蛋白酶抑制劑，樣本處理時(shí)在冰上操作。

2.目的蛋白有多個(gè)亞型，分子量都不同：查閱文獻(xiàn)或數(shù)據(jù)庫(kù)，了解目的蛋白的信息。

3.細(xì)胞系傳代次數(shù)過(guò)多：選擇傳代少的原代細(xì)胞系進(jìn)行樣品制備。

4.目的蛋白具有多種修飾形式，如乙酰化、甲基化、烷基化、磷酸化、糖基化等，查閱文獻(xiàn)或數(shù)據(jù)庫(kù)分析，獲得蛋白序列的修飾位點(diǎn)信息，確定該蛋白是否存在不同長(zhǎng)度的編碼mRNA。

5.蛋白有聚合體，如二聚體、四聚體和多聚體：SDS-PAGE 電泳上樣前煮沸 10 min以增強(qiáng)蛋白質(zhì)解聚變性。

6.上樣量過(guò)高或抗體濃度過(guò)高：適當(dāng)減少上樣量和抗體濃度。

7.洗滌不充分

8.一抗特異性不高：重新選擇或制備高特異性的抗體

條帶彎曲，拖尾等不同條帶問(wèn)題

蛋白轉(zhuǎn)印效率低

分子量大的蛋白

1.甲醇濃度太高：降低甲醇濃度至 10%（V/V）以下。

2.蛋白結(jié)合時(shí)間不夠：使用濕轉(zhuǎn)代替半干轉(zhuǎn)。延長(zhǎng)轉(zhuǎn)印時(shí)間。

3.蛋白凝膠濃度太高：降低凝膠濃度，轉(zhuǎn)印 buffer 中添加 0.1%SDS，促進(jìn)蛋白溶解。

分子量小的蛋白

1.小蛋白在膜上結(jié)合量少：使用蛋白結(jié)合能力更強(qiáng)的膜。增大 SDS-PAGE 凝膠濃度。

2.使用小孔徑印跡膜，如 0.1μm 或 0.2 μm Protran 印跡膜。

3.轉(zhuǎn)印 buffer 中殘留的 SDS 影響蛋白與膜的結(jié)合：轉(zhuǎn)印 buffer 中不要有 SDS。轉(zhuǎn)印前凝膠與轉(zhuǎn)印 buffer 平衡至少 15min 以上。

4.轉(zhuǎn)印 buffer 中甲醇濃度太低：提高甲醇的濃度（15%-20%）

5.蛋白結(jié)合時(shí)間不夠：調(diào)低電壓，延長(zhǎng)轉(zhuǎn)印時(shí)間。

分子量很小的蛋白質(zhì)＜20KD，選擇什么膜？

1）可選擇孔徑0.22um的PVDF膜或者NC膜，轉(zhuǎn)膜時(shí)間縮短，另外可采用Tricine-SDS-PAGE體系；

2）也可以選擇PSQ 膜，同時(shí)縮短轉(zhuǎn)移時(shí)間。也可以將兩張膜疊在一起，再轉(zhuǎn)移。

顯影時(shí)，底片漆黑一片，是為什么？

1） 可能是紅燈造成的, 膠片本來(lái)就被曝光了，可以在完全黑暗的情況下操作，看是否有改善。

2）顯影時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，一般3-5分鐘就夠了，特殊情況需摸索顯色時(shí)間。

膜上出現(xiàn)反像

可能二抗偶聯(lián)HRP的濃度過(guò)高，可適當(dāng)降低二抗的濃度。

WB實(shí)驗(yàn)選擇“麗春紅”還是“考馬斯亮藍(lán)”染料？

Ponceau S 檢測(cè)到的蛋白質(zhì)水平為 200 ng 以上，與 PVDF、硝化纖維或尼龍膜兼容?？捡R斯亮藍(lán)僅與 PVDF 膜兼容，但可以檢測(cè) 50 ng 及以上的蛋白質(zhì)。建議檢測(cè) 50-200 ng 范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)，選擇考馬斯亮藍(lán)。但是，在 CST，我們通常首選Ponceau S，因?yàn)樗俣瓤臁⒁子?、柔和而有效?/span>

Western Blot“淬滅”？

1.含HRP的抗體：抗體方面來(lái)說(shuō)，可以采用適當(dāng)降低抗體的濃度，發(fā)光實(shí)驗(yàn)時(shí)快速操作來(lái)解決“淬滅”的問(wèn)題

2.發(fā)光液：可以選用發(fā)光穩(wěn)定的ECL發(fā)光液來(lái)解決“淬滅”的問(wèn)題。

如何選擇蛋白Marker？

1.根據(jù)蛋白Marker分子量范圍：盡可能選擇分子量范圍比較廣的蛋白marker，以便適用于更多蛋白的檢測(cè)。如果已經(jīng)確定集中在大分子量蛋白或小分子量蛋白的檢測(cè)，最好選擇對(duì)應(yīng)分子量范圍的marker，以便獲得更好的指示。

2.考慮使用預(yù)染蛋白Marker：因?yàn)轭A(yù)染Marker在電泳或轉(zhuǎn)膜過(guò)程中可以被直接觀察到，方便我們判斷電泳的進(jìn)程，如電泳是否發(fā)生異?；蚴欠駥⒛繕?biāo)蛋白完全分開(kāi)等，也可以判斷轉(zhuǎn)膜的是否完全，轉(zhuǎn)膜后還可以直接在膜上標(biāo)記蛋白分子量。

3.考慮Marker條帶數(shù)是否在分子量范圍內(nèi)分布均勻，沒(méi)有廣泛的空白區(qū)域。是否多種顏色，以便于快速識(shí)別不同的分子量大小。此外，五顏六色的Marker也為實(shí)驗(yàn)結(jié)果添加一抹亮色。還要注意選擇條帶銳利清晰的Marker，這樣才能更精確的指示蛋白的分子量。

WB實(shí)驗(yàn)中如何正確設(shè)置內(nèi)參？

1.根據(jù)實(shí)驗(yàn)樣本的種屬選擇適合的內(nèi)參。如哺乳動(dòng)物組織或細(xì)胞通常用β-actin，GAPDH等，植物樣本，可以選用Plant actin、Rubisco等。

2.根據(jù)目的蛋白的表達(dá)位置選擇合適的內(nèi)參。如要檢測(cè)全細(xì)胞或細(xì)胞質(zhì)中的蛋白表達(dá)，可以選擇β-actin，GAPDH和β-Tubulin作為內(nèi)參，如要檢測(cè)細(xì)胞核中的蛋白，可以選用PCNA和TBP作為內(nèi)參，線粒體蛋白的內(nèi)參選擇COX IV、VDAC1/Porin，胞膜蛋白內(nèi)參Na+/K+-ATPase 等。

3.一般選擇內(nèi)參與要檢測(cè)的目的蛋白的分子量最好相差5KD以上，以防止條帶互相影響。

免疫組化和WB兩個(gè)試驗(yàn)的一抗和二抗可以共用嗎？

免疫組化可以用來(lái)進(jìn)行定位，但是不能精確定量，而且有時(shí)會(huì)有假陽(yáng)性，不易與背景區(qū)分；WB可以特異性檢測(cè)某個(gè)蛋白質(zhì)分子，如抗體選擇合適，靈敏度很高。WB進(jìn)行定量，但是不能定位。

兩種實(shí)驗(yàn)的一抗有時(shí)候不能通用，公司的產(chǎn)品說(shuō)明一般都會(huì)說(shuō)明可以進(jìn)行什么實(shí)驗(yàn)，在免疫組化時(shí)，是否適合石蠟切片或者冰凍切片。

同一蛋白樣品能同時(shí)進(jìn)行兩種因子的WB檢測(cè)嗎？

可以，有時(shí)如果抗體特異性高且效價(jià)高，同時(shí)使用2種一抗，可在一張膜上檢測(cè)2種不同蛋白。

膜蛋白或胞漿蛋白，WB操作需要注意什么？

如果是膜蛋白和胞漿蛋白，所用的去垢劑要溫和得多，需要加上NaF去抑制磷酸化酶的活性，推薦使用商業(yè)化的混合抑制劑。