1992年，一位日本研究人員Higuchi提出了qPCR（Quantitative real-time PCR）技術(shù)——在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號的變化來實時監(jiān)測PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過CT值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對起始模板進(jìn)行定量分析的一項技術(shù)。經(jīng)歷從研發(fā)到市場化，1996年，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司ABI推出了首臺qPCR儀。

目前，主要通過兩種方式對PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤——熒光染料法與熒光探針法，既可以定量分析，也可以用來定性分析。

根據(jù)qPCR檢測系統(tǒng)所生成的數(shù)據(jù)，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線和熔解曲線，經(jīng)過數(shù)據(jù)處理就可以得到起始模板濃度。

qPCR染料法特點

染料法經(jīng)濟(jì)實惠，但是由于染料只要是雙鏈DNA就會與之結(jié)合發(fā)光，特異性不強(qiáng)，需要做熔解曲線觀察其特異性。

在高通量測序?qū)嶒炇抑校ㄒ匝簶颖緸槔?，運(yùn)用核酸提取試劑盒提取出基因組DNA，再將基因組DNA打斷、拼接、重組，制備出重塑的DNA模型即基因文庫。為了對建庫產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)量檢測，應(yīng)用的就是qPCR熒光染料技術(shù)，該技術(shù)屬于相對定量方法。

在PCR反應(yīng)體系中，包含一對引物和一個特異性熒光探針。該探針為一段特異性寡核苷酸序列，兩端分別標(biāo)記了一個熒光報告基團(tuán)和一個熒光淬滅基團(tuán)。探針完整時，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收，不發(fā)出熒光。PCR擴(kuò)增時，DNA聚合酶利用酶的外切活性將探針酶切降解，報告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，發(fā)出熒光。最終，被qPCR儀監(jiān)測信號并檢出。

根據(jù)熒光定量檢測系統(tǒng)生成的擴(kuò)增曲線，讀取標(biāo)本CT值。根據(jù)結(jié)果判斷原則，對每一個標(biāo)本進(jìn)行準(zhǔn)確的結(jié)果判讀。

探針法只有在探針結(jié)合的片段才能收集信號，具有很好的特異性，但是合成探針成本較高。

目前，國內(nèi)PCR市場因為新冠疫情帶來巨大增量，行業(yè)景氣度上升。隨著疫情防控的發(fā)展，暴露出基層檢測能力不足的短板，衛(wèi)健委多次發(fā)布政策要求加強(qiáng)實驗室建設(shè)和增強(qiáng)核酸檢測能力。廣闊的市場需求和因技術(shù)快速迭代升級帶來應(yīng)用范圍拓展及成本下降，以及伴隨而來的政府支持，PCR市場規(guī)模快速增長。PCR行業(yè)居于分子診斷黃金賽道，市場規(guī)模有望長期高增。雖然數(shù)字PCR已經(jīng)出現(xiàn)，但目前在臨床應(yīng)用上仍處于探索階段。所以，qPCR技術(shù)在未來分子診斷市場中仍然扮演重要角色。